Preamble . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . III
Preface . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . V
Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . XV
CHAPTER 1
History of X-Ray Crystallography . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
1.1 The Discovery of X-Rays. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
1.2 The Nature of X-Rays. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.3 The Origins of Crystallography . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.4 The Discovery of Diffraction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.5 The First Structures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
1.6 Sir William Henry Bragg’s Brilliant Move . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
1.7 Biology Comes into Play . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.8 Rosalind Franklin and the Mystery of Cliché 51 . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.9 CCP4: Collaborative Computational Project No. 4 . . . . . . . . . . . . . . . 14
Timeline . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
Related videos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
CHAPTER 2
Sample Preparation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
2.1 Knowing Your Sample . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
2.1.1 Prediction of Structured Regions of a Protein. . . . . . . . . . . . . . 19
2.1.2 Biochemical Approach: Limited Proteolysis . . . . . . . . . . . . . . . 22
2.2 Cloning, Production, Sample Purification . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
2.2.1 Cloning . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
2.2.2 (Over)production . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
2.3 Purification. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
Related videos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
CHAPTER 3
Crystal Features and Properties . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
3.1 The Crystal Assembly . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
3.2 Crystal Symmetries . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
3.3 The Bravais Lattices . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
3.4 The Reciprocal Lattice . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
Related videos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
CHAPTER 4
X-Rays and Diffraction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
4.1 Why X-Rays: The Interaction of Light and Matter . . . . . . . . . . . . . . . 39
4.1.1 The Choice of X-Rays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
4.1.2 The Interaction of Molecules with X-Rays . . . . . . . . . . . . . . . . 40
4.1.3 How X-Rays Interact with a Crystal Lattice . . . . . . . . . . . . . . . 44
4.2 Diffraction: Bragg’s Law . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
4.3 Anomalous Diffusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
Related videos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
CHAPTER 5
Crystallisation of a Biological Macromolecule . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
5.1 General Principles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
5.1.1 Properties of Proteins in Solution . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
5.1.2 General Scheme of Protein Behaviour in Solution . . . . . . . . . . . 53
5.1.3 Crystallisation Agents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
5.2 Approaches, Platforms . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
5.2.1 Equipment Needed . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
5.2.2 Crystallisation Methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
5.2.3 Crystallisation Approaches . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
5.2.4 Optimisation of Crystallisation Conditions . . . . . . . . . . . . . . . . 59
Related videos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
CHAPTER 6
Trip to a Synchrotron . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
6.1 How to Generate X-Rays? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
6.1.1 First X-Ray Generators . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
6.1.2 Synchrotron Radiation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
6.2 Radiation Damage and Crystal Freezing . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
6.2.1 Radiation Damage . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
6.2.2 Flash Freezing of Crystals . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
6.2.3 Fast Freezing of Crystals with Liquid Nitrogen . . . . . . . . . . . . . 66
6.3 Experimental Hutch: The Crystal Environment . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
6.3.1 Example of PROXIMA-1 Beamline . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
6.3.2 The Control Room . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
6.3.3 Diffraction Data . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
Related videos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
CHAPTER 7
Acquisition, Processing and Analysis of Diffraction Data. . . . . . . . . . . . . . . . 73
7.1 Collection Strategy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
7.1.1 Crystal Characterisation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
7.1.2 The Anomalous Signal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
7.2 Diffraction Data Processing . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
7.3 Analysis of Diffraction Data . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80
7.3.1 Friedel Law . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80
7.3.2 The Choice of the Laue Group . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80
7.3.3 Assessment of Data Quality . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80
Related videos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
CHAPTER 8
Fourier Transform . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85
8.1 Introduction to the Fourier Transform. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85
8.1.1 Fourier Transform Applied to Music. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86
8.1.2 Fourier Transform Applied to Crystal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87
8.2 The Fourier Transform and the Phase Problem . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
8.2.1 The Fourier Transform . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
8.2.2 The Phase Problem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93
Related videos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
CHAPTER 9
The Patterson Function . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
9.1 The Phase Problem and the Patterson Function . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
9.2 Properties of the Patterson Function . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
9.2.1 First Property . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
9.2.2 Second Property . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
9.2.3 Third Property . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98
9.3 Applications of the Patterson Function . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98
Related videos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99
CHAPTER 10
Molecular Replacement . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101
10.1 Molecular Replacement . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102
10.1.1 Patterson Function and Molecular Replacement . . . . . . . . . . . 102
10.2 Evaluation of the Molecular Replacement Result . . . . . . . . . . . . . . . . 105
Related videos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106
CHAPTER 11
Experimental Phasing . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107
11.1 Isomorphous Replacement . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107
11.1.1 Natives and Derivatives Data . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107
11.1.2 Patterson Function and Harker Sections . . . . . . . . . . . . . . . . 109
11.1.3 Vector Representation of Harker Section . . . . . . . . . . . . . . . . 110
11.2 Anomalous Diffusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111
11.2.1 The Anomalous Signal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111
11.2.2 Breaking Friedel’s Law . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113
11.2.3 The Use of Anomalous Signal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114
11.3 Phases Combination . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115
Related videos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116
CHAPTER 12
Phases Improvement and Model Building . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117
12.1 Lack of Closure and Figure of Merit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117
12.2 Phases Improvement . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120
12.2.1 Electron Density Modifications . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120
12.2.2 Iterative Loop of Phases Improvement . . . . . . . . . . . . . . . . . 121
12.3 Molecular Model Building . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122
Related videos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124
CHAPTER 13
Model Refinement and Evaluation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125
13.1 Refinement . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125
13.1.1 Iterative Process of Refinement . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127
13.1.2 The 2Fo-Fc and Fo-Fc Maps . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 128
13.1.3 Refinement Limits . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129
13.2 Three-Dimensional Structure Validation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131
Related videos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133
To Go Further . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135
